Die Auswahl des Kontroll-Mix hängt von der Größe ihrer Zielbande ab. Für mittlere und große Targets zwischen 300 und 1000 bp empfehlen wir Kontroll-Mix A (231 bp). Für kleine Targets (100-250 bp) sollte der Kontroll-Mix B verwendet werden. Wenn keine interne Kontrolle gewünscht ist, verwenden Sie bitte Kontroll-Mix C.

Wenn Sie das PCR-Produkt aufreinigen und weiterverwenden wollen, z. B. für die DNA-Sequenzierung, empfehlen wir, den Kontroll-Mix komplett wegzulassen und stattdessen das fehlende Volumen in der PCR-Reaktion durch PCR-Wasser zu ersetzen. Ein beliebiger Gelladepuffer kann mit einem Aliquot des PCR-Produkts vor der Gelelektrophorese gemischt werden.

Der Snooplex-Lysepuffer wird bei der GVG GM in der Routine für die DNA-Extraktion aus allen Arten von Probenmaterial von Maus und Ratte eingesetzt. Dabei stellte sich heraus, dass die für Tupfer ürsprünglich empfohlenen Bedingungen (30 Minuten bei 70°C) z.B. für Schwanzbiopsien nicht funktionieren. In einer Serie von Versuchsreihen wurde untersucht, ob man Lyse-Bedingungen definieren kann, die für alle Proben gleich gut geeignet sind. Dies ist der Fall. Wir nutzen hierfür eine Inkubation bei 90°C für 60 Minuten, bei leichtem Schütteln (500 rpm).

 

Wichtig: Es sollte nicht zu viel an Probenmaterial für die DNA-Extraktion eingesetzt werden. 1-3 mm von einer Schwanzspitze oder 1 – 2 Ohrstanzen sind völlig ausreichend, um bei optimierten PCR-Bedingungen bis zu 50 PCR-Ansätze mit jeweils 2 µl DNA-Extrakt durchzuführen. Die wesentliche Voraussetzung dafür ist die Nutzung der Snooplex PCR-Chemie und die für geringe DNA-Mengen optimierten PCR-Bedingungen (Primermenge).

Wenn keine Kontrollbande und auch keines Ihrer PCR-Produkte sichtbar sind, wurde zu wenig DNA zugegeben. Entweder gab es ein Problem bei der die Probenahme (der Abstrich muss dreimal gedreht werden) oder es wurde keine DNA in den PCR-Mix zugegeben.

 

Wichtig: Sie müssen sicherstellen, dass ausreichend Zellmaterial über die Abstriche gesammelt wird. Die Probenentnahme ist DER entscheidende Schritt und muss daher ordnungsgemäß durchgeführt werden. Beachten Sie, dass Sie Zellmaterial von der Schleimhaut sammeln und nicht nur Speichelflüssigkeit. Speichel an sich enthält keine DNA!

Die im Kit enthaltenen PCR-Reagenzien und Kontrollprimer sind über einen weiten Temperaturbereich robust, so dass Sie Ihre Standardbedingungen verwenden können. Allerdings wird vor dem routinemäßigen Einsatz des Kits empfohlen, an einer vorhandenen transgen-positiven DNA-Probe zu überprüfen ob die PCR optimal funktioniert. Andernfalls sollten die PCR-Parameter entsprechend angepasst werden, z.B. andere Annealing-Temperatur (+2 und -2°C), Reduzierung der Primermenge.

 

Wichtig: Für jede PCR gilt, dass es immer ein optimales Verhältnis zwischen der Anzahl an DNA-Molekülen (Targets) und der Menge an Primern gibt. Die DNA-Menge aus Tupfern ist im Vergleich zu Schwanzbiopsien erheblich geringer. Daher sind die ursprünglich validierten Standard-PCR-Bedingungen für geringe DNA-Mengen logischerweise suboptimal und sollten angepasst werden. Die beiden wichtigsten Parameter zur Verbesserung der PCR-Bedingungen sind die Anzahl der PCR-Zyklen und die Menge der verwendeten PCR-Primer. Testen Sie daher anhand einer DNA-Verdünnungsreihe Ihre Standardbedingungen und passen Sie diese gegebenenfalls an. Als gute Orientierung, wie weit man die DNA verdünnen kann, dient die interne PCR-Kontrolle im Kontroll-Mix A oder B. So lange diese noch sichtbar ist, liegt eine ausreichende Mange an DNA für eine PCR vor. Erhöhen Sie dafür die Anzahl der PCR-Zyklen auf 40. In der Regel kann die Menge an Target-spezifischen PCR-Primern, die der Reaktion zugesetzt wird, um 50% oder sogar mehr reduziert werden. Die für geringe DNA-Mengen gefundenen, optimalen PCR-Bedingungen funktionieren übrigens auch wunderbar bei größeren DNA-Mengen.